Pozo-Rojas, Carlos delMontalvo-Quirós, SandraRufo, LourdesBueno, José MaríaCalero, MacarenaMonroy, FranciscoHerráez-Aguilar, Diego2026-08-032026-08-032026-03Pozo-Rojas, C D, Montalvo-Quirós, S, Rufo, L, Bueno, J M, Calero, M, Monroy, F & Herráez-Aguilar, D 2026, 'Computational Microscopy Reveals Compound-Specific Flickering Phenotypes of Red Blood Cells Under Flavonoid Exposure', Membranes, vol. 16, no. 3, 95. https://doi.org/10.3390/membranes160300952077-0375PubMedCentral: PMC13027723https://hdl.handle.net/10641/8215Publisher Copyright: © 2026 by the authors.El parpadeo (flickering) de la membrana de los eritrocitos (glóbulos rojos, GR) surge de la interacción entre las fluctuaciones térmicas, la elasticidad del citoesqueleto y los procesos de no equilibrio impulsados metabólicamente, lo que lo convierte en un indicador sensible del estado mecánico de la membrana. Presentamos aquí un marco de microscopía computacional que integra la morfometría de campo claro con espectroscopía de parpadeo de alta velocidad para fenotipar la mecánica de eritrocitos individuales bajo exposición a flavonoides. Como prueba de concepto, se incubaron eritrocitos humanos de un único donante con flavonoides estructuralmente distintos (quercetina, apigenina y rutina) preparados a concentraciones subhemolíticas, asegurando la preservación de la integridad de la membrana. Se extrajeron descriptores de forma estáticos y espectros de fluctuación dinámica a partir de contornos celulares segmentados, y se analizaron mediante descomposición en modos de Fourier para obtener firmas mecánicas específicas de cada compuesto. Aunque la morfología general se mantuvo mayoritariamente discocítica en todas las condiciones, el tratamiento con flavonoides indujo alteraciones reproducibles en los espectros de parpadeo y en los parámetros mecánicos efectivos, revelando fenotipos dinámicos distintos que dependen de la estructura del flavonoide. En particular, los flavonoides aglicona mostraron patrones de modulación diferentes a los del compuesto glicosilado, consistentes con interacciones diferenciales con la membrana. El análisis combinado de geometría y dinámica proporcionó un poder discriminativo mayor que cualquiera de las dos modalidades por separado. Estos resultados establecen la microscopía computacional como un enfoque sensible y sin marcaje para mapear perturbaciones específicas de compuesto en la mecánica y el parpadeo de la membrana de los GR, con posibles aplicaciones en biofísica de membranas, cribado de interacciones fármaco-membrana y fenotipado mecánico de células individuales. [Traducción automática al español; idioma original: inglés.]Red blood cell (RBC) membrane flickering arises from the interplay between thermal fluctuations, cytoskeletal elasticity, and metabolically driven non-equilibrium processes, making it a sensitive reporter of membrane mechanical state. Here, we introduce a computational microscopy framework that integrates bright-field morphometry with high-speed flickering spectroscopy to phenotype single-cell RBC mechanics under flavonoid exposure. As a proof of concept, human erythrocytes from a single donor were incubated with structurally distinct flavonoids (quercetin, apigenin, and rutin) prepared at sub-hemolytic concentrations, ensuring preservation of membrane integrity. Static shape descriptors and dynamic fluctuation spectra were extracted from segmented cell contours and analyzed through Fourier-mode decomposition to obtain compound-specific mechanical signatures. While gross morphology remained largely discocytic across conditions, flavonoid treatment induced reproducible alterations in flickering spectra and effective mechanical parameters, revealing distinct dynamical phenotypes that depend on flavonoid structure. In particular, aglycone flavonoids exhibited modulation patterns that differed from the glycosylated compound, consistent with differential membrane interactions. The combined analysis of geometry and dynamics provided enhanced discriminative power compared to either modality alone. These results establish computational microscopy as a sensitive, label-free approach to map compound-specific perturbations of RBC membrane mechanics and flickering, with potential applications in membrane biophysics, drug–membrane interaction screening, and single-cell mechanical phenotyping.242534576enghttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/apigeninbiophysicscomputational microscopyerythrocytesflavonoidsflickeringmembrane mechanicsquercetinrutinErythrocytesBiophysicsRutinMembrane mechanicsComputational microscopyFlavonoidsApigeninQuercetinFlickeringChemical Engineering (miscellaneous)Process Chemistry and TechnologyFiltration and SeparationJournal ArticleYesjournal articleopen access10.3390/membranes16030095https://www.scopus.com/pages/publications/105034109387https://www.scopus.com/pages/publications/105034109387#tab=citedByhttp://webofscience.com/wos/woscc/full-record/WOS:001725883000001?&SID=EUW1ED0D34ceIKsxXZkWzEaujjnma