Senthil Kumar, Charitra S.Valades Cruz, Cesar A.Sison, MiguelVesga, Arturo G.Rey-Barroso, JavierCurcio, ValentinaAlemán-Castañeda, Luis A.Alonso, Miguel A.Poincloux, RenaudMavrakis, ManosBrasselet, Sophie2026-09-302026-09-302026-05-12Senthil Kumar, C S, Valades Cruz, C A, Sison, M, Vesga, A G, Rey-Barroso, J, Curcio, V, Alemán-Castañeda, L A, Alonso, M A, Poincloux, R, Mavrakis, M & Brasselet, S 2026, '4polar3D single molecule imaging of 3D orientation in dense actin networks using ratiometric polarization splitting', Nature Communications , vol. 17, no. 1, 4246. https://doi.org/10.1038/s41467-026-70852-y2041-1723PubMedCentral: PMC13168503https://hdl.handle.net/10641/8405Publisher Copyright: © The Author(s) 2026.La microscopía de localización y orientación de moléculas individuales (SMOLM) tiene como objetivo medir simultáneamente la posición y la orientación de moléculas individuales, generando imágenes de superresolución codificadas por orientación mediante la estimación tanto de su orientación media 3D como del grado de sus fluctuaciones angulares (wobble). La mayoría de los enfoques SMOLM existentes se basan en la ingeniería de las funciones de dispersión puntual de las moléculas individuales, lo que requiere configuraciones ópticas complejas y tiempos computacionales largos que pueden ser un obstáculo en entornos celulares densos con alta densidad de detección y condiciones de imagen desafiantes. En este trabajo, proponemos un método más simple y eficaz llamado 4polar3D, basado en la estimación de las intensidades de moléculas individuales proyectadas sobre cuatro canales polarizados con aperturas numéricas controladas. Esta estrategia permite mediciones de orientación 3D de moléculas individuales dentro de un rango acimutal de 0-180°, además de su rango de fluctuación angular y su localización 2D, utilizando una configuración que requiere una complejidad de alineación mínima. Además, se basa en una estimación de intensidad pura, lo que hace que el procesamiento de datos sea considerablemente más rápido que el análisis complejo de la forma de la PSF y relativamente insensible a las aberraciones geométricas. Demostramos que 4polar3D puede resolver la organización molecular a nanoescala en estructuras densamente pobladas de células completas, revelando redes de filamentos de actina orientadas en 3D en lamelipodios y podosomas densamente empaquetados. [Traducción automática al español; idioma original: inglés.]Single Molecule Orientation and Localization Microscopy (SMOLM) aims at simultaneously measuring the position and orientation of single molecules, generating orientation-encoded super-resolved images by estimating both their 3D mean orientation and the extent of their angular fluctuations (wobble). Most existing SMOLM approaches rely on the engineering of single molecules’ point spread functions, which requires complex optical setups and long computational times that can be an obstacle in dense cellular environments with high detection density and challenging imaging conditions. In this work, we propose a simpler and effective method named 4polar3D, based on the estimation of single molecule intensities projected onto four polarized channels with controlled numerical apertures. This strategy enables 3D orientation measurements of single molecules within a 0-180° azimuthal range in addition to their angular range of fluctuations and their 2D localization, using a setup requiring minimal alignment complexity. It is moreover based on pure intensity-estimation, making data processing considerably faster than complex PSF shape analysis and relatively insensitive to geometrical aberrations. We demonstrate that 4polar3D can resolve nanoscale molecular organization in whole cells’ crowded structures, uncovering 3D-oriented actin filament networks in densely packed lamellipodia and podosomes.144075801enghttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Filament organizationLocalizationMicroscopyKeratocytesPositionsOrderGeneral ChemistryGeneral Biochemistry, Genetics and Molecular BiologyGeneralGeneral Physics and AstronomyYesjournal articleopen access10.1038/s41467-026-70852-yhttps://www.scopus.com/pages/publications/105038598807https://www.scopus.com/pages/publications/105038598807#tab=citedBy