Sivill, SandraViñuela, MarcosGarcía-Puentes, DiegoMoreno-Serna, LuciaNuñez-Borque, EmilioJiménez-Saiz, RodrigoVila-Gonzalo, MariaFernández-Arquero, MiguelReal-Arévalo, IreneIborra, SalvadorSubiza, Jose LuisCantillo, Jose Fernando2026-08-032026-08-032026Sivill, S, Viñuela, M, García-Puentes, D, Moreno-Serna, L, Nuñez-Borque, E, Jiménez-Saiz, R, Vila-Gonzalo, M, Fernández-Arquero, M, Real-Arévalo, I, Iborra, S, Subiza, J L & Cantillo, J F 2026, 'Impact of cross-linking stoichiometry on the structure and allergenicity of glutaraldehyde-polymerized allergen extracts', Frontiers in Immunology, vol. 17, 1748277. https://doi.org/10.3389/fimmu.2026.17482771664-3224PubMedCentral: PMC12980651https://hdl.handle.net/10641/8212Publisher Copyright: Copyright © 2026 Sivill, Viñuela, García-Puentes, Moreno-Serna, Nuñez-Borque, Jiménez-Saiz, Vila-Gonzalo, Fernández-Arquero, Real-Arévalo, Iborra, Subiza and Cantillo.Introducción: Los extractos alergénicos polimerizados se utilizan ampliamente en la inmunoterapia con alérgenos (AIT) para reducir la alergenicidad y mejorar la seguridad. Sin embargo, el impacto de la estequiometría de entrecruzamiento en las propiedades estructurales y alergénicas de estos polímeros sigue sin caracterizarse de forma suficiente. Este estudio investiga sistemáticamente cómo la variación de las proporciones glutaraldehído-proteína influye en los polímeros resultantes y en su posible relevancia para la AIT. Métodos: Se polimerizaron extractos de polen de Phleum pratense y Betula verrucosa utilizando cinco proporciones diferentes de glutaraldehído-proteína. Los polímeros resultantes se caracterizaron estructuralmente mediante SDS-PAGE, resonancia magnética nuclear (RMN), microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectrometría de masas (MS). La alergenicidad se evaluó midiendo la reactividad de la inmunoglobulina E (IgE) mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western blot y ensayo de activación de mastocitos (MAT). La inmunogenicidad se evaluó analizando la IgG específica en suero y las respuestas linfocitarias ex vivo en ratones inmunizados con la formulación de polímero menos alergénica. Resultados: Todas las condiciones de entrecruzamiento produjeron polímeros con diferencias claras en tamaño, morfología y rendimiento. A pesar de conservar perfiles peptídicos similares a los alérgenos nativos, según confirmó la MS, los polímeros mostraron mayor estabilidad, según demostró la RMN, y una alergenicidad significativamente reducida, según ELISA y MAT. Cabe destacar que el mayor tamaño y densidad del polímero, determinados por RMN y TEM, se correlacionaron con una menor alergenicidad. Los polímeros de alta densidad más extensamente entrecruzados, optimizados para una alergenicidad mínima, provocaron respuestas inmunogénicas comparables a las inducidas por los extractos nativos cuando se ensayaron frente a alérgenos no modificados. Conclusión: La estequiometría de entrecruzamiento determina de forma crítica las propiedades estructurales e inmunológicas de los extractos alergénicos polimerizados. Ajustar la proporción glutaraldehído-proteína para producir polímeros densos altamente polimerizados permite un perfil equilibrado de seguridad y eficacia para su uso en la AIT. [Traducción automática al español; idioma original: inglés.]Introduction: Polymerized allergen extracts are widely used in allergen immunotherapy (AIT) to reduce allergenicity and enhance safety. However, the impact of cross-linking stoichiometry on the structural and allergenic properties of these polymers remains insufficiently characterized. This study systematically investigates how varying glutaraldehyde-to-protein ratios influence the resulting polymers and their potential relevance for AIT. Methods: Pollen extracts from Phleum pratense and Betula verrucosa were polymerized using five different glutaraldehyde-to-protein ratios. The resulting polymers were structurally characterized using SDS-PAGE, nuclear magnetic resonance (NMR), transmission electron microscopy (TEM), and mass spectrometry (MS). Allergenicity was evaluated by measuring the immunoglobulin E (IgE) reactivity through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting, and mast cell activation test (MAT). Immunogenicity was assessed by analyzing the serum-specific IgG and ex vivo lymphocyte responses in mice immunized with the least allergenic polymer formulation. Results: All cross-linking conditions produced polymers with distinct differences in size, morphology, and yield. Despite retaining similar peptide profiles to native allergens, as confirmed by MS, the polymers exhibited increased stability, as shown by NMR, and significantly reduced allergenicity, according to ELISA and MAT. Notably, increased polymer size and density, as determined by NMR and TEM, correlated with lower allergenicity. The most extensively cross-linked high-density polymers, optimized for minimal allergenicity, elicited immunogenic responses comparable to those induced by native extracts when tested against unmodified allergens. Conclusion: Cross-linking stoichiometry critically shapes the structural and immunological properties of polymerized allergen extracts. Adjusting the glutaraldehyde-to-protein ratio to produce highly polymerized, dense polymers enables a well-balanced profile of safety and efficacy for use in AIT.1715557660enghttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/allergensglutaraldehyde-modified extractshypoallergenicityimmunotherapypolymerizationImmunology and AllergyImmunologyYesjournal articleopen access10.3389/fimmu.2026.1748277https://www.scopus.com/pages/publications/105032548138https://www.scopus.com/pages/publications/105032548138#tab=citedByhttp://webofscience.com/wos/woscc/full-record/WOS:001712218500001?&SID=EUW1ED0D34ceIKsxXZkWzEaujjnma