RAB5C Increases Endothelial Release of VWF by Regulating Vesicle Trafficking

Share

Abstract

ANTECEDENTES: – Los niveles anómalos de VWF (factor de von Willebrand) son un factor de riesgo para el tromboembolismo venoso (TEV) y la hemorragia. Los estudios de asociación del genoma completo para el VWF han identificado nuevos genes candidatos que podrían regular los niveles de VWF en humanos, incluido RAB5C (proteína RAB5C asociada a RAS [rat sarcoma]). Planteamos la hipótesis de que RAB5C regula la liberación de VWF desde las células endoteliales. MÉTODOS: – Estudiamos el efecto de RAB5C sobre el tráfico vesicular en células endoteliales humanas. Realizamos interferencia CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) dirigida a 2 variantes genéticas vinculadas a niveles alterados de VWF y evaluamos la expresión de RAB5C mediante retrotranscripción-PCR cuantitativa. Silenciamos RAB5C o sobreexpresamos RAB5C de tipo silvestre, constitutivamente activo o dominante negativo; y a continuación medimos la exocitosis de VWF desde células endoteliales de vena umbilical humana hacia el medio mediante ELISA. Realizamos marcaje por proximidad y espectrometría de masas para identificar las vías de señalización intracelular que median los efectos de RAB5C sobre la exocitosis de VWF. RESULTADOS: – Encontramos que 2 variantes genéticas (rs9915255 y rs9912088, identificadas por estudios de asociación del genoma completo para niveles de VWF) regulan la expresión de RAB5C en células endoteliales derivadas de células madre. A continuación silenciamos o sobreexpresamos RAB5C en células endoteliales para evaluar su efecto sobre la liberación de VWF. El silenciamiento de RAB5C disminuyó la liberación de VWF tras la estimulación con histamina, mientras que la sobreexpresión de RAB5C o de RAB5C constitutivamente activo aumentó la liberación endotelial de VWF. Para explorar la vía de señalización intracelular que media los efectos de RAB5C sobre la exocitosis de VWF, realizamos marcaje por proximidad y espectrometría de masas. Identificamos 147 proteínas próximas a RAB5C, muchas de las cuales están implicadas en el tráfico vesicular. A partir de este cribado, identificamos SNAP29 (proteína asociada a sinaptosoma 29), una proteína asociada a SNARE (receptor de unión a NSF [factor sensible a N-etilmaleimida] soluble) que desempeña un papel crucial en la fusión vesicular, como un interactor clave de RAB5C que regula la exocitosis de VWF. CONCLUSIONES: – En conjunto, nuestros datos demuestran que RAB5C regula la liberación de VWF en parte mediante el control de SNAP29 sobre el tráfico vesicular en células endoteliales. Estos hallazgos validan los datos de epidemiología genética que vinculan RAB5C con los niveles de VWF en humanos y aportan nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares que regulan la exocitosis de VWF. [Traducción automática al español; idioma original: inglés.]