4polar3D single molecule imaging of 3D orientation in dense actin networks using ratiometric polarization splitting

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Abstract

La microscopía de localización y orientación de moléculas individuales (SMOLM) tiene como objetivo medir simultáneamente la posición y la orientación de moléculas individuales, generando imágenes de superresolución codificadas por orientación mediante la estimación tanto de su orientación media 3D como del grado de sus fluctuaciones angulares (wobble). La mayoría de los enfoques SMOLM existentes se basan en la ingeniería de las funciones de dispersión puntual de las moléculas individuales, lo que requiere configuraciones ópticas complejas y tiempos computacionales largos que pueden ser un obstáculo en entornos celulares densos con alta densidad de detección y condiciones de imagen desafiantes. En este trabajo, proponemos un método más simple y eficaz llamado 4polar3D, basado en la estimación de las intensidades de moléculas individuales proyectadas sobre cuatro canales polarizados con aperturas numéricas controladas. Esta estrategia permite mediciones de orientación 3D de moléculas individuales dentro de un rango acimutal de 0-180°, además de su rango de fluctuación angular y su localización 2D, utilizando una configuración que requiere una complejidad de alineación mínima. Además, se basa en una estimación de intensidad pura, lo que hace que el procesamiento de datos sea considerablemente más rápido que el análisis complejo de la forma de la PSF y relativamente insensible a las aberraciones geométricas. Demostramos que 4polar3D puede resolver la organización molecular a nanoescala en estructuras densamente pobladas de células completas, revelando redes de filamentos de actina orientadas en 3D en lamelipodios y podosomas densamente empaquetados. [Traducción automática al español; idioma original: inglés.]